Storage and purification adaptations for the isolation of total RNA from the dura mater / Adaptações no armazenamento e purificação para o isolamento de RNA total da dura-máter

Abstract Background RNA extraction is a step that precedes several molecular techniques. The fibrous tissue, more specifically the dura mater, has several limitations in routine protocols, and lacks optimization protocols to overcome these problems. Objective To test stock reagents and purification kits, optimizing commercial kit protocols for RNA extraction from the dura mater. Methods Dura mater samples were obtained from eight Wistar rats and maintained in two different stabilizers. The samples were purified using four different protocols, and the RNA was evaluated for the yield and purity in NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States). Beta-actin gene was used for analyzing gene expression, since is one of the most used reference genes. Results The RNA preservation was similar in both stabilizers. The addition of an incubation step prior the purification protocols allowed better tissue digestion and RNA recovery. The RNA purified using the protocols membrane-based showed higher quality than liquid-liquid purification. This impact was observed in the 3-week evaluation using RT-qPCR. Conclusion Stabilizers are efficient for RNA preservation and membrane-based purification protocols are more suitable for RNA recovery from dura mater tissue, allowing the evaluation of gene expression in this type of tissue. Adaptations in the dura mater RNA extraction protocol differ from the pre-established protocols because it takes into account the peculiarity of fibrous tissue and low cellularity. In addition to providing a low-cost mechanism, based on techniques that are part of the laboratory routine, it is possible to improve the quality of the extracted material, ensuring greater efficiency in the use of subsequent techniques.

Resumo Antecedentes A extração de RNA é uma etapa que antecede várias técnicas moleculares. O tecido fibroso, mais especificamente a dura-máter, apresenta várias limitações nos protocolos de rotina e carece de protocolos de otimização para superar estes problemas. Objetivo Testar reagentes de estoque e kits de purificação, otimizando protocolos de kits comerciais para extração de RNA da dura-máter. Métodos Amostras de dura-máter foram obtidas de oito ratos Wistar e mantidas em dois estabilizadores diferentes. As amostras foram purificadas em quatro protocolos diferentes e o RNA foi avaliado quanto ao rendimento e pureza no NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States). O gene da beta-actina foi utilizado para analisar a expressão gênica, uma vez que é um dos genes de referência mais utilizados. Resultados A preservação do RNA foi semelhante em ambos os estabilizadores. A adição de uma etapa de incubação antes dos protocolos de purificação permitiu uma melhor digestão do tecido e recuperação de RNA. O RNA purificado pelos protocolos baseados em membrana apresentou qualidade superior ao da purificação líquido-líquido. Este impacto foi observado na avaliação de três semanas usando RT-qPCR. Conclusão Os estabilizadores são eficientes para preservação do RNA e os protocolos de purificação baseados em membrana são mais adequados para recuperação de RNA do tecido da dura-máter, permitindo a avaliação da expressão gênica neste tipo de tecido. As adaptações no protocolo de extração de RNA da dura-máter diferem dos protocolos preestabelecidos porque leva em consideração a peculiaridade do tecido fibroso e com baixa celularidade. Além de fornecer um mecanismo de baixo custo, baseado em técnicas que fazem parte da rotina laboratorial, é possível melhorar a qualidade do material extraído, garantindo maior eficácia no uso de técnicas subsequentes.

Human papillomavirus infection and risk factors to cervical cancer in asymptomatic women in the region of the Northeast of Brazil / Infecção pelo papillomavirus humano e fatores de risco para o cancer cervical em mulheres assintomáticas em uma região do Nordeste do Brasil

Objective: This study sought to identify the presence of HPV infection and the risk factors related to susceptibility to cervical cancer in asymptomatic women. Methods: It is a cross-sectional study with 428 users attended Basic Health Units, in Arapiraca, Alagoas, Brazil. Sociodemographic, behavioral variables, and cytopathological reports were collected. Molecular detection of the HPV virus was performed by Nested-PCR. Statistical analysis was conducted with SPSS version 22.0. Results: A total of 428 women were studied, HPV DNA detected in 39.2% (n = 168), with a mean age of 41 years old. There was an association of HPV with use of oral contraceptives (p <0.016) and alcoholism (p <0.038). It was showed a higher frequency of positive HPV in women older than 25 years old (88.7%), up to 5 sexual partners (93.4%), up to 3 pregnancies (71.4%), and with the cytopathologic results within the limits of normality (61.9%). HPV was identified in 40.3% (104/258) of the women with results within the limits of normality. Conclusion: Our results suggest that the use of oral contraceptives and alcoholism may be considered as possible risk factors related to cervical oncogenesis. With this, it is necessary to propose interventions aimed at the health education of this population, actions of prevention, and early detection.

Objetivo: Este estudo buscou identificar a presença de infecção pelo HPV e os fatores de risco relacionados à suscetibilidade ao câncer do colo do útero em mulheres assintomáticas. Métodos: Trata-se de um estudo transversal com 428 usuários atendidos em Unidades Básicas de Saúde, em Arapiraca, Alagoas, Brasil. Foram coletados relatórios sociodemográficos, variáveis comportamentais e citopatológicos. A detecção molecular do vírus HPV foi realizada por Nested-PCR. A análise estatística foi realizada com SPSS versão 22.0. Resultados: Foram estudadas 428 mulheres, com DNA de HPV detectado em 39,2% (n =168), com média de idade de 41 anos. Houve associação do HPV com o uso de anticoncepcional oral (p<0,016) e alcoolismo (p <0,038). Foi evidenciada maior frequência de HPV positivo em mulheres maiores de 25 anos (88,7%), até cinco parceiros sexuais (93,4%), até três gestações (71,4%) e com resultados citopatológicos dentro dos limites da normalidade (61,9%). O HPV foi identificado em 40,3% (104/258) das mulheres com resultados dentro dos limites da normalidade. Conclusão: Nossos resultados sugerem que o uso de anticoncepcionais orais e o alcoolismo podem ser considerados como possíveis fatores de risco relacionados à oncogênese cervical. Com isso, é necessário propor intervenções voltadas para a educação em saúde dessa população, ações de prevenção e detecção precoce.

INVASIVE TRIPLE NEGATIVE BREAST CANCER WITH BASAL AND NON-BASAL-LIKE IMMUNOPHENOTYPES: PROGNOSTIC IMPLICATIONS / Carcinoma invasivo de mama triplo negativo com imunofenótipo basal e não basal: implicações prognósticas Darley de Lima Ferreira Filho1*, Nancy Cristina Ferraz de Lucena Ferreira1, Maria do Carmo Abreu

Objectives: The objective of the study was to compare the postoperative staging and clinical development outcomes in a period of three years with the histopathological and immunohistochemical characteristics considered prognostic and/or predictive factors in patients being treated for triple negative type of breast cancer in the Barão Lucena Hospital, Recife, Pernambuco. Method: The study was conducted with 125 female patients suffering from triple negative breast cancer who underwent surgical treatment in the mastology service of Barão Lucena Hospital from 2009 to 2012. The clinical and pathological features of the tumors were studied and correlated with basal and non-basal subtypes. A descriptive data analysis was carried out using tables and/or graphs for qualitative variables. Association analysis was performed using χ2 test for independence. In tables that showed expected frequency lower than 5, in more than 20% of cells, we used the Fisher's exact test. In addition, the odds ratio (OR) and the confidence interval (CI) for OR were calculated. In the entire analysis, a 5% significance level was considered. Results: M ean a ge w as 4 9 y ears; r egarding r ace, b lack w as p resent i n 8 3 ( 66.4%). The most common histological type was ductal, in 111 (88.8%). The pathological stage I/II was the most common, in 87 (69.6%) patients. A total of 71 patients (56.8%) showed no axillary metastasis. Regarding the type of surgery, the conservative one was performed in 57 (45.6%), including sectorectomy and oncoplastic surgery. The recurrence was present in 30 patients, basal in 16 (53.3%) patients and 14 (46.7%) in the non-basal, and bone metastasis was the most frequent. Conclusion: In this triple-negative tumor sample, the most important facts related to survival were: being aged less than 40 years, histological type, cytokeratin CK5/6 and higher significance level of the factors EGFR and KI-67.

Objetivos: O objetivo do estudo foi correlacionar o estadiamento pós-cirúrgico e a evolução clínica em um período de três anos com as características histopatológicas e imunoistoquímicas consideradas fatores prognósticos e/ou preditivos nas pacientes em tratamento de câncer de mama do tipo triplo negativo do Hospital Barão de Lucena, Recife, Pernambuco. Método: O estudo foi feito com 125 pacientes do sexo feminino portadoras de câncer de mama triplo negativo e que foram submetidas a tratamento cirúrgico no serviço de mastologia do Hospital Barão de Lucena no período de 2009 a 2012. Nessas pacientes foram estudadas as características clínicas e patológicas dos tumores, as quais foram correlacionadas com os subtipos basal e não basal. A análise descritiva dos dados foi feita através de tabelas e/ou gráficos para variáveis qualitativas. Para análise de associação, foi utilizado o teste do χ2 para independência. Nas tabelas que apresentaram frequência esperada menor que 5, em mais de 20% das caselas, foi utilizado o teste exato de Fisher. Além disso, foi calculada a razão de chance (OR) e o intervalo de confiança (IC) para OR. Em toda a análise foi considerado nível de significância de 5%. Resultados: A média de idade foi de 49 anos; com relação à raça, tivemos a cor negra em 83 (66,4%) delas. O tipo histológico mais comum foi o ductal, em 111 (88,8%) pacientes. O estágio patológico I/II foi o mais comum, em 87 (69,6%) delas. Um total de 71 (56,8%) pacientes não demonstrou comprometimento axilar. Com relação ao tipo de cirurgia, a conservadora foi utilizada em 57 (45,6%) pacientes, incluindo setorectomia e técnicas de oncoplastia. A recorrência esteve presente em 30 pacientes, sendo basal em 16 (53,3%) e não basal 14 (46,7%) delas, nas quais a metástase óssea foi a mais frequente. Conclusão: Nessa amostra de tumores triplo negativo, os fatos mais importantes associados à sobrevida foram a idade abaixo de 40 anos, o tipo histológico, a citoqueratina CK5/6 e o grau de significância maior dos fatores EGFR e KI-67.

Infecção cervical por papilomavírus humano: genotipagem viral e fatores de risco para lesão intraepitelial de alto grau e câncer de colo do útero / Human papillomavirus cervical infection: viral genotyping and risk factors for high-grade squamous intraepithelial lesion and cervix cancer

OBJETIVO: analisar, em mulheres com HPV em colo do útero, as características da infecção viral e os fatores de risco para lesão intraepitelial de alto grau e carcinoma cervical. MÉTODOS: realizou-se um estudo caso-controle com mulheres com HPV em colo do útero atendidas em serviço de Ginecologia de referência vinculado ao SUS, em Recife, Nordeste do Brasil. No grupo de casos (72 mulheres com lesão intraepitelial de alto grau ou carcinoma cervical) e de controles (176 mulheres com colpocitologia normal ou com alterações benignas), foram pesquisados seis genótipos virais (HPV 16, 18, 31, 33, 6 e 11) em material da ecto- e endocérvice com primers MY09/MY11. As variáveis independentes foram hierarquizadas em três níveis de determinação: distal (sociodemográficas), intermediário (comportamentais) e proximal (realização anterior de colpocitologia). A homogeneidade das proporções foi testada (χ2). Obtiveram-se ORs não ajustadas e, na modelagem final, realizou-se regressão logística hierarquizada com o ajuste do efeito de cada variável sobre o desfecho pelas variáveis do mesmo nível e de níveis anteriores de causalidade. RESULTADOS: em 76,6 por cento das 248 mulheres participantes do estudo, o genótipo viral da infecção cervical foi identificado. Predominaram genótipos de alto risco oncogênico (83,4 por cento nos casos e 67,1 por cento nos controles), principalmente HPV 16 e 31. Foram identificados como fatores de risco (a) distais: residir em zona rural (OR=2,7; IC95 por cento: 1,1-6,2), menos de três anos de estudo (OR=3,9; IC95 por cento: 2,0-7,5) e renda familiar inferior a dois salários mínimos (OR=3,3; IC95 por cento: 1,0-10,5); (b) intermediário: número de gestações igual ou superior a quatro (OR=2,0; IC95 por cento: 1,0-3,7); (c) proximal: ausência de colpocitologia anterior (OR=9,7; IC95 por cento: 2,4-38,2). CONCLUSÕES: em mulheres usuárias do SUS do Nordeste do Brasil predominam os genótipos virais 16 e 31 em infecções cervicais ...

PURPOSE: to analyze the characteristics of viral infection and the risk factors for high-grade squamous intraepithelial lesion and cervical carcinoma in women with cervical HPV infection. METHODS: a case-control study was conducted on women with cervical HPV at a Gynecology reference service enrolled at the Public Health System, located in Recife, Northeastern Brazil. The groups of cases (72 women with high-grade squamous intraepithelial lesion or cervical cancer) and controls (176 women with normal Pap smear or benign alterations) were investigated for six viral genotypes (HPV 16, 18, 31, 33, 6, 11) in ecto- and endocervical material using MY09/MY11 primers. The independent variables were ranked in three levels of determination: distal (sociodemographic), intermediate (behavioral) and proximal (previous Pap smear). The homogeneity of proportions was tested (χ2), unadjusted Odds Ratios (OR) were obtained and hierarchical logistic regression was applied to the final model, with adjustment of the effect of each variable to the outcome based on the variables in the same and previous levels of causality. RESULTS: the viral genotype of cervical infection was identified in 76.6 percent of the 248 women participating in the study. High-risk HPV genotypes (83.4 percent of cases and 67.1 percent of controls) were predominant, especially HPV 16 and 31. The distal risk factors identified were: living in a rural area (OR=2.71, 95 percentCI: 1.18-6.23), less than three years of study (OR=3.97, 95 percentCI: 2.09-7.54) and family income below two minimum wages (OR=3.30, 95 percentCI: 1.04-10.51); intermediate: four or more pregnancies (OR=2.00, 95 percentCI: 1.06-3.76); and proximal: absence of a previous Pap smear (OR=9.74, 95 percentCI: 2.48-38.28). CONCLUSIONS: genotypes 16 and 31 of cervical HPV infection are predominant among women assisted by the Public Health System in Northeastern Brazil. Socioeconomic and reproductive factors, as well ...